Fehlerquellen RNA-Isolation

[Flauscheding]

Huhu,
ich bräuchte mal wieder eure Hilfe.
Im Rahmen meiner Laborarbeit isoliere ich im Moment RNA, d.h. ich lerne noch. Nun sagte mir mein Betreuer, dass ich sehr sorgfältig und sauber arbeiten muss, da die RNA extrem fehler- und kontaminationsempfindlich ist . Das tue ich und dennoch erhalte ich recht schlechte Werte bei der RNA-Bestimmung. Vor allem kratze ich sehr scharf an einer Proteinkontamination meiner Proben vorbei und das nervt mich ein wenig. Dummerweise fällt mir bei der Fehleranalyse nichts mehr ein was ich ändern oder wo den Fehler suchen könnte.
Vielleicht habt ihr ein paar Tips oder Ideen?
Liebe Grüße,
verzweifeltes Flausche

[test]

Mit was für Zellen arbeitest du?
Welchen Kit oder System zur Isolierung benutzt du?

[Flauscheding]

Also ich arbeite mit humanen Lungencarcinomzellen.
Ein Kit hab ich gar nicht, ich "töte" die Zellen mit Trizol und isoliere die RNA dann mit Chloroform wasche mit Ethanol.
Eine Anleitung dazu habe bekommen und halte mich dran, arbeite sauber und pippettiere genau, aber irgendwie läufts nicht so, wie ich es mir erhofft hatte *hmpf*.

[test]

Die meisten Leute (inkl. mir) sind zu faul das von Hand zu machen und benutzen Kits (ich z.B. Qiagen RNeasy Kit).
Wenn du ein Problem mit Proteinkontamination hast, scheint es ja nicht daran zu liegen, dass du "unsauber" arbeitest (RNAsen Kontamination) sondern irgendwas an der Reinigung nicht optimal ist. HAt dein Betreuer da keine Verbesserungsidee?
Ansonsten könntest du mal in ein BUch wie den Experimentator Molekularbiologie gucken, der gibt oft ganz hilfreiche Tipps.

[test]

NOch ein Nachtrag, du meinst mit Chloroform wahrscheinlich Phenol/Chloroform oder? Der Schritt dient ja zur Trennung von Protein von Nukleinsäuren. Du mußt dabei sauber nur die wässrige Phase nehmen, sonst kommt es natürlich wieder zur Proteinkontamination.
Um höhere Reinheit zu bekommen könntest du diese Schritt wahrscheinlich auch zwei Mal hintereinander machen, falls du das nicht schon machst.
Würde mal deinen Betreuer fragen, was er dazu meint.